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ALY è il peptide antimicrobico su cui era incentrata la tesi di dottorato di Lucia. Io ho effettuato delle simulazioni tramite Desmond, su Metrocubo, in cui ricreavo le condizioni in cui il peptide è stato testato a Zurigo.

Il primo passo è stato la costruzione del peptide e dell'omologo avente funzione azobenzenica, poi ho effettuato un clean e un rilassamento.

Poi sono passato alle simulazioni da 20ns di:

  1. ALY in acqua
  2. ALY in acqua e membrana POPC
  3. ALY in acqua e membrana POPC-POPG 90-10
  4. ALY-AZO in acqua
  5. ALY-AZO in acqua e membrana POPC
  6. ALY-AZO in acqua e membrana POPC-POPG 90-10

N.B. Le impostazioni utilizzate nelle dinamiche sono le stesse utilizzate nel report riguardante l'APP.

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Introduzione.

I recettori per gli endocannabinoidi (CB) appartengono alla famiglia dei recettori accoppiati a proteine G e, in particolare, all'isoforma Gi; questo tipo di recettori inibisce l'adenilatociclasi e la produzione di cAMP con conseguente inibizione di alcune vie, di solito quelle stimolate dalle catecolamine e, per quanto riguarda i recettori CB1, si è dimostrata anche l'inibizione dei canali al Ca2+ di tipo N e P/Q e la stimolazioni dei canali K+. Nel caso dei recettori CB1, essi sono espressi in varie parti del SNC, dall'ippocampo ai gangli della base, e nel midollo spinale mentre i recettori CB2 si trovano a livello periferico, nella milza, nelle tonsille e sulle cellule del sistema immunitario[1]; i loro ligandi sono, appunto, cannabinoidi endogeni ed esogeni naturali o di sintesi. Si tratta di proteine che presenta sette tratti transmembrana ad alfa elica la cui struttura completa, però, non è stata ancora determinata. Come si può notare dalla figura 1, il recettore di tipo 1 (CB1) è più grande del recettore di tipo 2.

Figura 1. Recettore per gli endocannabinoidi di tipo 1 e di tipo 2

Come riportato in letteratura [2-5] la struttura tridimensionale di CB1 non è stata ancora determinata sperimentalmente a causa di numerosi problemi relativi alla cristallizzazione dell'intera proteina. Fino ad ora ci si è basati sulla struttura della rhodopsina (PDB: 1F88) o del recettore β-adrenergico (PDB: 2RH1) prestando poca attenzione alle porzioni intra ed extracellulari a causa della presenza di numerosi loop. Al fine di creare una struttura migliore abbiamo deciso di prestare attenzione anche a queste regioni e per farlo ci siamo basati sul programma YASARA e sul suo knowledge-based forcefield YASARA2[6].

Homology modeling.

Allo scopo di riuscire a predire la struttura tridimensionale del recettore CB1 abbiamo inviato la sequenza .fasta, ricavata dal sito UniProt[7], a tre diversi server che ricercano omologie di sequenza, nello specifico Muster[8], Phyre2[9] e Sparks-X[10]; i risultanti PDB trovati sono stati usati come template per un homology modeling eseguito usando Yasara[6] (C:\yasara\mcr). Nello specifico i risultati sono elencati nella tabella 1 e i risultati comuni ai due server sono stati evidenziati con colori simili. Si noti che sono tutti PDB relativi al recettore β-adrenergico.

Server

PDB

Catena

Informazioni

SPARKS-X

2Z73

A

Crystal structure of squid rhodopsin

1U19

A

Crystal Structure of Bovine Rhodopsin at 2.2 Angstroms Resolution

2VT4

B

Turkey beta1 adrenergic receptor with stabilizing mutations and bound cyanopindolol

3EM1

A

Crystal structure of the mimivirus NDK +Kpn-N62L double mutant complexed with dTDP

2RH1

A

High resolution crystal structure of human B2-adrenergic G protein-coupled receptor

3D4S

A

Cholesterol bound form of human beta2 adrenergic receptor

3EM1

A1

Crystal structure of the mimivirus NDK +Kpn-N62L double mutant complexed with dTDP

1XME

A

Structure of Recombinant Cytochrome ba3 Oxidase from Thermus thermophilus

3FYI

A

Catalytic core subunits (I and II) of cytochrome C oxidase from Rhodobacter sphaeroides in the reduced state bound with cyanide

3DH4

A

Crystal Structure of Sodium/Sugar symporter with bound Galactose from vibrio parahaemolyticus

2KS9

A

Solution conformation of substance P in water complexed with NK1R

4IAQ

A1

Crystal structure of the chimeric protein of 5-HT1B-BRIL in complex with dihydroergotamine (PSI Community Target)

MUSTER

4N6H

A

1.8 A Structure of the human delta opioid 7TM receptor (PSI Community Target)

3SN6

R2

Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex

3D4S

A1

Cholesterol bound form of human beta2 adrenergic receptor

3PBL

A1

Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with eticlopride

2RH1

A1

High resolution crystal structure of human B2-adrenergic G protein-coupled receptor

3RZE

A1

Structure of the human histamine H1 receptor in complex with doxepin

2VT4

B

Turkey beta1 adrenergic receptor with stabilizing mutations and bound cyanopindolol

2VT4

A

Turkey beta1 adrenergic receptor with stabilizing mutations and bound cyanopindolol

Tabella 1. Elenco dei PDB ricavati dai server Muster e SPARKS-X e usati come template. Con colori uguali sono evidenziati i PDB comuni ai due server

Per quanto riguarda il terzo server usato, Phyre2, esso genera automaticamente una struttura finale frutto di homology fra i template trovati.

La procedura di homology del software Yasara prevede un PSI-Blast (Position-Specific Iterated Blast) della sequenza in modo da creare una matrice posizione-specifica (PSSM); questa matrice contiene una riga per ogni aminoacido e una colonna per ogni posizione della sequenza (per esempio se è un peptide di 10 aminoacidi vi saranno 10 colonne) e verrà usata per effettuare uno screening di allineamento delle strutture fornite come template. Al termine della procedura di allineamento si procede alla minimizzazione dell'energia della struttura risultante; il tutto viene eseguito sulla base del force field Yasara2.

Sono state dunque realizzate due strutture (C:\Users\federica\Google Drive\work in progress\CB1\Sparks-X\CB1.yob; C:\Users\federica\Google Drive\work in progress\CB1\Muster\ CB1_2.yob) sulla base dei template forniti dai server Muster e Sparks-X e che sono state utilizzate a loro volta, insieme alla struttura finale fornita da Phyre2, come template per un nuovo homology modeling in modo da fornire una conformazione definitiva chiamata CB1_ultimate (C:\Users\federica\Google Drive\work in progress\CB1\Ultimate). Dal momento che il recettore CB1 appartiene alla famiglia delle GPCR, esso è caratterizzato da una struttura centrale a sette α-eliche che ne costituisce la porzione transmembrana. I loop interni ed esterni sono stati ricavati tramite knowledge-base potentials incorporati all'interno del force field Yasara2[6]. Il confronto fra le varie strutture e quella finale è illustrato nella Fig.2

Figura 2. Confronto fra le strutture di CB1; da sinistra: struttura creata sui template forniti da Sparks-X, struttura creata sui template forniti da Muster, struttura fornita da Phyre2, struttura finale costruita utilizzando le precedenti come template. La struttura originaria è colorata in blu mentre gli altri colori indicano le zone ibridizzate.

Per validare la struttura appena creata, è stato realizzato un Ramachandran plot (Fig. 3) nel quale il 82% dei residui si trova all'interno delle aree azzurre e circa il 40% all'interno di quelle rosse. I residui che si trovano al di fuori delle ottimali combinazioni Phi/Psi sono quelli appartenenti ai loop intra ed extracellulari la cui struttura non è definita completamente.

Figura 3. Ramachandran plot della struttura CB1_ultimate_2.0 . Residui all'interno del grafico (rosso + azzurro): 81.99%; Residui senza impedimenti sterici (rosso): 40.04%

Nel tentativo di migliorare la struttura del segmento intracellulare, è stata salvata la sequenza della parte di interesse ed è stato effettuato un Blast per ricercare sequenze simili. La porzione intracellulare (ultimi 38 aminoacidi) è stata ricostruita per homology modeling sulla base dei template forniti dai siti citati in precedenza (C:\Users\federica\Google Drive\work in progress\CB1\Ultimate\Intra\ Intra_Sparks-X). Dalla struttura CB1_ultimate sono stati cancellati gli ultimi 38 aminoacidi e vi è stata unita la porzione intracellulare ottenuta in precedenza. La struttura ibrida è stata dunque minimizzata usando il programma Yasara ottenendo così una nuova struttura finale (C:\Users\federica\Google Drive\work in progress\CB1\Ultimate\Intra\ Hybrid\Hybrid.yob; Fig 4).

Figura 4. Struttura di CB1 con porzione C-terminale modificata (Hybrid)

Il miglioramento nella struttura finale è evidenziato dal Ramachandran plot che mostra come circa l'84% dei residui si trovi all'interno delle aree azzurre e circa il 34% non ha alcun impedimento sterico.

Figura 5. Ramachandran plot della struttura ibrida. Residui all'interno del grafico (rosso + azzurro): 83.90%; Residui senza impedimenti sterici (rosso): 36.86%

Come evidenziato in letteratura[11, 12] il recettore CB1 è palmitoilato in vivo e ciò pare rivelarsi essenziale per ciò che concerne la sua funzionalità. Come recentemente ipotizzato da Oddi et al.[12] un secondo sito di legame per il colesterolo, basandosi sul modello del recettore β-adrenergico usato come modello, e che questo potrebbe influenzare ulteriormente la struttura e la funzionalità del recettore, ma non vi sono ancora evidenze sperimentali riguardo quest'ultima considerazione. La struttura ibrida è stata minimizzata ed inserita in una membrana di fosfatidiletanolammina (PEA) per simulare la sua posizione reale usando il force field YASARA2[6] e la macro md_runmembrane_limit.mcr (C:\yasara\mcr\lab13); questa macro permette di costruire un doppio strato lipidico di composizione scelta all'interno del quale viene praticato un poro in cui si alloggia la proteina compattata, si procede poi a rilassare gradualmente la proteina in modo da adattarla alle dimensioni del poro e permettere alla membrana di adattarsi ad essa. Segue poi una neutralizzazione della cella con NaCl 0.9% e 10 ps di dinamica per stabilizzare il sistema ed evitare che l'acqua entri nel doppio strato lipidico (Fig. 6).

Figura 6. Struttura ibrida inserita in un doppio strato di fosfatidiletanolammina. Il residuo di palmitato è evidenziato sulla sinistra

Conclusioni.

I risultati ottenuti seguendo il nostro protocollo hanno portato ad ottenere una struttura tridimensionale del recettore CB1 più completa e migliorata rispetto a quanto riportato finora in letteratura. L'attenzione riservata ai domini intracellulari ed extracellulari ci rende fiduciosi riguardo alla struttura finale prevista, supportata anche dai dati mostrati. Questa struttura può essere utilizza come punto di partenza per future validazioni attraverso docking di ligandi noti e il protocollo utilizzato può servire alla previsione delle strutture di altre proteine di membrana.

Riferimenti.

1. Demuth, D.G. and A. Molleman, Cannabinoid signalling. Life sciences, 2006. 78(6): p. 549-563.

2. Kuang, G., et al., In silico investigation of interactions between human cannabinoid receptor-1 and its antagonists. Journal of molecular modeling, 2012. 18(8): p. 3831-3845.

3. Montero, C., et al., Homology models of the cannabinoid CB1 and CB2 receptors. A docking analysis study. European journal of medicinal chemistry, 2005. 40(1): p. 75-83.

4. Shim, J.-Y., Transmembrane Helical Domain of the Cannabinoid CB1 Receptor. Biophysical Journal, 2009. 96(8): p. 3251-3262.

5. Shim, J.Y., W.J. Welsh, and A.C. Howlett, Homology model of the CB1 cannabinoid receptor: sites critical for nonclassical cannabinoid agonist interaction. Peptide Science, 2003. 71(2): p. 169-189.

6. Krieger, E., et al., Making optimal use of empirical energy functions: Forcefield parameterization in crystal space. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004. 57(4): p. 678-683. http://www.yasara.org.

7. UniProt. http://www.uniprot.org.

8. Wu, S. and Y. Zhang. MUSTER: improving protein sequence profile–profile alignments by using multiple sources of structure information. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 2008 [cited 72 2]; 547-556]. http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/MUSTER/.

9. Kelley, L.A. and M.J. Sternberg, Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server, in Nature protocols2009. p. 363-371. http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/index.cgi.

10. Yang, Y., et al., Improving protein fold recognition and template-based modeling by employing probabilistic-based matching between predicted one-dimensional structural properties of query and corresponding native properties of templates. Bioinformatics, 2011. 27(15): p. 2076-2082. http://sparks-lab.org/yueyang/server/SPARKS-X/.

11. Barnett-Norris, J., D. Lynch, and P.H. Reggio, Lipids, lipid rafts and caveolae: their importance for GPCR signaling and their centrality to the endocannabinoid system. Life sciences, 2005. 77(14): p. 1625-1639.

12. Oddi, S., et al., Effects of palmitoylation of Cys415 in helix 8 of the CB1 cannabinoid receptor on membrane localization and signalling. British journal of pharmacology, 2012. 165(8): p. 2635-2651.

Dopo un'iniziale fase di studio riguardante l'argomento, sono passato alla preparazione delle simulazioni.

Tutta la prima parte è stata svolta utilizzando la suite di Schrodinger, Maestro sul pc Metrocubo.

Il primissimo step è stato la scelta del peptide su cui effettuare i test, ovvero il dimero 2LZ3, presente su Protein Data Bank, della porzione transmembrana di APP. Questo è stato scaricato e preprocessato come di consueto: è stato effettuato un cleaning ed un refinement della struttura.

 

 

Il seguito il dimero 2LZ3 è stato immerso nelle membrane di POPC, POPC-PDHAPC 50-50 e POPC-POHDHAPC 50-50. La prima membrana è stata generata direttamente con MAESTRO mentre le altre due tramite i protocolli discussi nei report precedenti, con i programmi Cell2Microcosmos e Yasara.

 

Una volta pronte le membrane contenenti il dimero 2LZ3 preprocessato si è potuto passare alle simulazioni vere e proprie, da 100ns.

N.B per evitare di scrivere uno sterile elenco di informazioni, riguardante i comandi utilizzati per le simulazioni, ho preferito riportare gli screenshot delle finestre del programma, in modo che in futuro sia anche più semplice l'inserimento e il confronto dei valori.

 

Ora il passo successivo sarà effettuare tutte le analisi del caso e passare ad una metadinamica ma di questo parlerò nei prossimi report.

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Docking rigido

Il target scelto è la porzione F(1)-ATPase mitocondriale del bovino, il pdb 2JIZ è dell’enzima inibito dal resveratrolo.

Link al paper: Mechanism of inhibition of bovine F1-ATPase by resveratrol and related polyphenols.

I ligandi sono:

5 azo attivi (A1-A2-A3-A4-A5)

2 azo non attivi (B10-B11)

2 noti inibitori dell’ATPase (RES=resveratrolo, PIT= piceatannolo).

Il file yob di ogni molecola è stato salvato con questo nome: F1-2jiz_ligand.yob

La macro usata è: dock_run_Lucia_ATPSynt.mcr

Risultati

Binding energy[kcal/mol]

Ligandi

A1

A2

A3

A4

A5

B10

B11

PIT

RES

Valore di Binding dei primi 3 cluster 8,907 9,463 9,104 9,030 9,627 8,803 9,827 9,266 9,128
8,814 9,450 9,093 8,670 9,504 8,672 9,550 9,242 9,027
8,677 9,449 9,082 8,557 9,400 8,464 8,616 8,571 8,211
Media 8,799 9,454 9,093 8,752 9,510 8,646 9,331 9,026 8,789

Correlazione Binding energy/MIC50

C. albicans S. aureus Binding
A1 15 17 9,51 =(8,799-8,4)/0,084*2
A2 12 15 25,10 =(9,454-8,4)/0,084*2
A3 3,5 7 16,50 =(9,093-8,4)/0,084*2
A4 5 10 8,39 =(8,752-8,4)/0,084*2
A5 3 7 26,44 =(9,510-8,4)/0,084*2
B10 30 30 5,87 =(8,646-8,4)/0,084*2
B11 30 30 22,17 =(9,331-8,4)/0,084*2
PIT 14,91 =(9,026-8,4)/0,084*2
RES 9,25 =(8,789-8,4)/0,084*2

Riassumo le cose da fare nel mese di marzo (soprattutto con la metadinamica):

proj
Annexin I Binding S100/AnnI

Virtual screening N terminale

Yadamp2 Preparare script Yadamp/grimd per il folding di corti peptidi Lo script deve incorporare le idee del bias exchange metadynamics
APP Binding energy

Effetto della membrana

SMS1 Folding bias exchange
Valinomycin Best conformation

Calcolo binding energy VLM/met

Calcolo binding energy VM/memb

SMD Yasara

Metadynamics con la distanza VLM/Met come CV

Metadynamics con la distanza VLM/memb come CV

ALY/AzoALY Dinamiche in membrana/analisi

Binding energy membrana

Folding in membrana

metadyn
Assisted folding

 

Period Name Topic Location Key dates
Mar 4-6 CDDD Modeling Verona
Apr 2-4 CECAM How proteins can shape and sense membranes--a closer look at hybrid models FU Berlin
May 7-9 CECAM Dissipative Particle Dynamics: Foundations to Applications Lausanne
May 25-27 CBSB Computational biophysics Gdansk April 30
Jun 10-12 CECAM Binding free energy and kinetics: computation meets experiments IIT Genova
Jun 25-27 ETH Symposium
Sept 7-10 ECCB Computational biology Strasbourg March 28
Sept 22-25 POLYSOLVAT Polymers Salerno
Oct ?? BIONAM2014 Salerno
Nov 5-7 Antibiotic alternatives for the new millennium Antibiotics London Sept 20